Красители Hoechst являются частью семейства синих флуоресцентных красителей, используемых для окрашивания ДНК. Эти бис-бензимиды были первоначально разработаны компанией Hoechst AG, которая пронумеровала все свои соединения так, что краситель Hoechst 33342 является 33342-м соединением, произведенным компанией. Есть три родственных красителя Hoechst: Hoechst 33258, Hoechst 33342 и Hoechst 34580. Красители Hoechst 33258 и Hoechst 33342 являются наиболее часто используемыми и имеют схожие спектры возбуждения-испускания.
Молекулярные характеристики
Оба красителя возбуждаются ультрафиолетовым светом при температуре около 350°С. нм, и оба излучают сине-голубой флуоресцентный свет вокруг максимума спектра излучения при 461 нм. Несвязанный краситель имеет максимальную эмиссию флуоресценции в диапазоне 510—540°С. диапазон нм. Краски Hoechst можно возбудить ксеноновой или ртутной дуговой лампой или ультрафиолетовым лазером. Существует значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и испускания, что делает красители Hoechst полезными в экспериментах, в которых используются несколько флуорофоров. Интенсивность флуоресценции красителей Hoechst также увеличивается с pH растворителя.
Красители Hoechst растворимы в воде и в органических растворителях, таких как диметилформамид или диметилсульфоксид . Концентрации могут быть достигнуты до 10 мг/мл. Водные растворы стабильны при 2-6 °C не менее шести месяцев в защищенном от света месте. Для длительного хранения растворы вместо этого замораживают при −20. °С или ниже.
Красители связываются с малой бороздкой двухцепочечной ДНК с предпочтением последовательностей, богатых аденином и тимином . Хотя красители могут связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, двухцепочечные ДНК, богатые AT, значительно усиливают флуоресценцию. Красители Hoechst проникают в клетки и могут связываться с ДНК в живых или фиксированных клетках . Таким образом, эти пятна часто называют суправитальными, что означает, что живые клетки выживают при обработке этими соединениями. Клетки, экспрессирующие специфические АТФ-связывающие кассетные белки-транспортеры, также могут активно транспортировать эти пятна из своей цитоплазмы.
Приложения
Концентрация 0,1-12 мкг/мл обычно используется для окрашивания ДНК в клетках бактерий или эукариот. Клетки окрашивают в течение 1-30 мин при комнатной температуре или 37 °C, а затем промывают для удаления несвязавшегося красителя. Зелёная флуоресценция несвязанного красителя Hoechst может наблюдаться на образцах, окрашенных слишком большим количеством красителя или частично промытых Красители Hoechst часто используются в качестве заменителей другого красителя нуклеиновой кислоты, называемого DAPI.
Основные различия между красителями Hoechst и DAPI:
- Красители Hoechst менее токсичны, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток.
- Дополнительная этильная группа в некоторых красителях Hoechst (Hoechst 33342) делает их более проницаемыми для клеток.
- Существуют красители для окрашивания ядер, которые обеспечивают жизнеспособность клеток после окрашивания.
Hoechst 33342 и 33258 гасятся бромдезоксиуридином (BrdU), который обычно используется для обнаружения делящихся клеток. Hoechst 33342 обладает в 10 раз большей проницаемостью для клеток, чем H 33258. Клетки могут интегрировать BrdU во вновь синтезированную ДНК в качестве замены тимидина. Когда BrdU интегрируется в ДНК, предполагается, что бром деформирует малую бороздку, так что красители Hoechst не могут достичь своего оптимального сайта связывания. Связывание красителей Hoechst ещё сильнее с BrdU-замещенной ДНК; однако никакой флуоресценции не происходит. Красители Hoechst можно использовать с BrdU для мониторинга прогрессирования клеточного цикла.
Красители Hoechst обычно используются для окрашивания геномной ДНК в следующих случаях:
- Флуоресцентная микроскопия и иммуногистохимия, часто с другими флуорофорами
- Проточная цитометрия для подсчета или сортировки клеток. Примером может служить использование красителей Hoechst для анализа того, сколько клеток популяции находится в какой фазе клеточного цикла.
- Обнаружение ДНК в присутствии РНК в агарозных гелях
- Автоматическое определение ДНК
- Хромосомная сортировка
Выделение Hoechst также используется для изучения гемопоэтических и эмбриональных стволовых клеток. Поскольку эти клетки способны эффективно выделять краситель, их можно обнаружить с помощью проточной цитометрии в так называемой боковой популяции. Это делается путем пропускания флуоресценции, испускаемой возбужденным Hoechst, через красный и синий фильтры и нанесения красного и синего Hoechst друг на друга.
Токсичность и безопасность
Поскольку красители Hoechst связываются с ДНК, они мешают репликации ДНК во время клеточного деления. Следовательно, они являются потенциально мутагенными и канцерогенными, поэтому при обращении с ними и их утилизации следует соблюдать осторожность. Окрашивание красителями Hoechst используется для сортировки спермы у домашнего скота и людей. Его безопасность обсуждалась.